微藻已被確定為生產高質量生物質和后續(xù)生物產品（如食品、飼料、營養(yǎng)補充劑、重組蛋白和生物燃料）的替代平臺。治療性蛋白質的傳統(tǒng)生物技術宿主，如大腸桿菌和哺乳動物CHO細胞，早已被確定為主要平臺，但最近的研究進展表明，微藻可能成為一種替代平臺。在本研究中，我們研究了萊茵衣藻在高密度異養(yǎng)培養(yǎng)中生產復雜人類重組蛋白的潛力。重組人蛋白ICAM-1的目標是使用補料分批策略從生物反應器中生長的細胞分泌到培養(yǎng)物的細胞外培養(yǎng)基，以實現高細胞密度。最終，這導致最大生物量滴度為40 g/L，重組蛋白滴度為50 mg/L。通過對其天然配體LFA-1的結合測定，藻類產生的ICAM-1蛋白顯示出與哺乳動物細胞培養(yǎng)產生的ICAM-1相當的生物活性。這項工作表明，萊茵梭菌是使用補料分批異養(yǎng)生長策略在高濃度下生產具有天然生物活性的復雜重組蛋白的可行選擇。
微藻是一類高度多樣的生物，主要由其光合生長能力來定義，盡管許多藻類也具有在有機基質上異養(yǎng)生長的能力。由于代謝的可塑性和潛在的培養(yǎng)策略，微藻可用于生產廉價的商品產品，如生物燃料和材料，以及高價值產品，如重組蛋白質和治療性化合物。萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）就是這樣一種既能自養(yǎng)又能異養(yǎng)生長的菌株，它是一種綠色微藻，幾十年來一直被用作模式生物，用于研究各種生物現象，包括光合作用、鞭毛運動、細胞器遺傳學和細胞周期[5]。最值得注意的是，該物種擁有一套開發(fā)的分子工具來促進遺傳操作，多年來，該藻類中已經產生了許多重組蛋白
由于之前在萊茵梭菌中所做的分子生物學工作，所有三個基因組（核、葉綠體和線粒體）都已測序和注釋，并且所有三個都能夠進行遺傳轉化。此外，重組蛋白在葉綠體和核基因組中都有表達，復雜的哺乳動物蛋白在兩個基因組中都有表達。C、 reinhardtii還能夠進行有性重組，這已被證明是在轉基因策略和高通量篩選技術的基礎上增加重組蛋白產量的有效手段[14]
萊茵梭菌的重組蛋白生產傳統(tǒng)上在葉綠體中更為成功，因為其遺傳學更為簡單，而且單個細胞器可以占細胞體積的70%。一些感興趣的重組蛋白已在葉綠體中表達，在非光合突變株[15]中產量高達總可溶性蛋白（TSP）的10.5%，但更典型的是TSP的0.5%到5%不等。葉綠體中重組蛋白生產的缺點是，一些翻譯后修飾沒有添加到葉綠體生產的蛋白質中，例如糖基化，這可能對蛋白質的生物活性至關重要，并且葉綠體中表達的重組蛋白不能針對其他亞細胞定位，阻礙某些代謝工程的可能性。在細胞核中表達的重組蛋白可以靶向細胞內的不同位置，包括內質網，從而接受翻譯后修飾，如糖基化。復雜的基因表達調控，以及對轉基因隨機整合到核基因組的強烈偏好，阻礙了核轉基因的重組蛋白表達。據報道，通過核基因組轉化獲得的重組蛋白滴度范圍為0.7 mg/L至15 mg/L，這對應于大多數核表達重組蛋白的總可溶性蛋白滴度為0.5%或更低。
提高萊茵梭菌中的重組蛋白滴度，我們可以控制三個因素：單個細胞系中的重組蛋白產量、培養(yǎng)物中的總生物量濃度以及重組蛋白在細胞內或培養(yǎng)基中的穩(wěn)定性。為了直接增加單個細胞系中的重組蛋白產量，我們可以修改啟動子或其他遺傳元件以增加轉錄，或通過使用誘變和交配進行間接遺傳修改，然后進行篩選以識別蛋白質積累增加的系。這些間接遺傳修飾可能涉及阻礙重組蛋白積累的天然蛋白酶的下調，或者可能涉及伴侶和其他促進重組蛋白折疊的酶的改變，從而減少新合成蛋白質的聚集和降解。通過改變培養(yǎng)物生長條件，例如降低培養(yǎng)物溫度以防止錯誤折疊，也可以影響重組蛋白降解和/或聚集的預防[23]。最后，只要在這些改變的生長條件下蛋白質表達保持高水平，增加總生物量濃度也是提高重組蛋白產量的有效途徑。這可以通過改進培養(yǎng)技術、優(yōu)化培養(yǎng)基或選擇在高生物量生長下表現良好的菌株來實現。
在簡單的分批生長中，最終生物量滴度受分批運行開始時添加的基質量的限制。最常見的消耗醋酸鹽作為有機碳基質，然而，培養(yǎng)基中高濃度的醋酸鹽抑制藻類生長，從而限制了產生的總生物量。當使用補料分批策略時，醋酸鹽可以在細胞消耗時超時添加，因此可以避免底物抑制的問題。幾種策略已被用于萊茵梭菌的補料分批生長。據報道，使用乙酸鈉的補料分批系統(tǒng)可產生1.5 g/L的生物量，但鈉的累積會抑制進一步的生長。為了解決這個問題，同一團隊設計了一個中空纖維細胞回收系統(tǒng)，在該系統(tǒng)中，使用過的培養(yǎng)基被丟棄，而細胞被保存在生物反應器中，從而產生9克/升。Fields等人部署的另一種分批補料策略包括使用pH計喂食萊茵梭菌乙酸，以控制酸性基質的添加，這導致報告的最高生長速率和生物量滴度為23.69 g/L生物量。然而，與其他能夠消耗葡萄糖作為基質的綠藻（如小球藻和柵藻）相比，即使是生長中獲得的最高生物量滴度也大大降低，其中生物量滴度分別達到271 g/L和286 g/L。
